背景：

      静息态功能磁共振成像(rs-fMRI)越来越多地被用于研究胶质瘤对大脑功能组织的影响。文献中出现了各种预处理技术和功能连接分析方法。然而,迄今为止还没有对不同方法如何影响观察结果进行系统性比较。

新方法：

      我们首先调查了当前文献并确定了该领域常用的替代分析方法。随后,我们系统地比较了图谱配准、分区方案和图论测量指标选择的替代方法,以区分胶质瘤患者(N=59)和年龄匹配的参考受试者(N=163)。

结果：

      我们的结果表明,与仿射配准相比,非线性配准改善了与图谱的结构匹配以及功能连接的测量。基于功能而非解剖的分区方案最大化了胶质瘤患者与参考受试者之间的对比。我们还证明了图论测量严重依赖于分区粒度、分区方案和图密度。

与现有方法的比较和结论: 

      我们目前的工作主要集中在胶质瘤患者rs-fMRI分析的技术优化上,因此从根本上不同于讨论胶质瘤导致的功能网络变化的大量论文。我们报告发现,胶质瘤导致的功能连接组改变的评估强烈依赖于分析方法,包括图谱配准、分区方案的选择和图论测量指标。本文发表在Journal of Neuroscience Methods杂志。

缩略词 

AAL 自动解剖标记
AFF 12参数仿射配准，无掩模
ANTs 高级归一化工具差异性算法（https://www.nitrc.org/projects/ants）
BOLD 血氧水平依赖
CFM 代价函数掩模
DVARS D指时间序列的时间导数；VARS指体素间的RMS方差
FC 功能连接
FWHM 全宽半最大
NL+M 非线性配准，带代价函数掩模
NL-M 非线性配准，无掩模
OASIS3 开放获取影像研究系列3
rs-fMRI 静息态功能磁共振成像
RSNs 静息态网络

关键词 胶质瘤 静息态功能磁共振成像 图谱配准 分区方案 分区粒度 图论测量指标

要点

• 胶质瘤患者需要非线性图谱配准来补偿解剖结构的变形。

• 非线性图谱配准减少了胶质瘤导致的功能连接异常的假性表现。

• 功能性分区增强了检测真实胶质瘤导致的功能连接异常的敏感性。

• 胶质瘤患者的功能连接异常仅在更精细的分区粒度下才明显。

1.引言

    功能磁共振成像(fMRI)越来越多地被用于研究胶质瘤患者(Lv et al., 2022, Sighinolfi et al., 2022)。静息态fMRI(rs-fMRI)数据分析涉及评估在无任务状态下观察到的血氧水平依赖(BOLD)信号自发波动的统计特征。BOLD信号的自发波动在大脑广泛分布的区域之间存在相关性。这种现象被称为功能连接(FC)。相关的拓扑结构被称为静息态网络(RSNs)(Beckmann et al., 2005)或内在连接网络(Seeley et al., 2007)。

    rs-fMRI在胶质瘤患者中的主要应用是术前功能映射(Dierker et al., 2017, Leuthardt et al., 2018, Park et al., 2020)和研究肿瘤导致的大脑功能重组(Daniel et al., 2021, Fox and King, 2018, Ghinda et al., 2018)。虽然基于任务的fMRI在这方面经常被使用,但rs-fMRI具有不依赖于患者执行任务范式的优势。此外,可以对rs-fMRI数据应用丰富多样的分析策略(Hacker et al., 2013, Zang et al., 2007, Zou et al., 2008)。尽管从先前的工作中学到了很多,例如(Fox and King, 2018, Ghinda et al., 2018),但关于胶质瘤患者的功能神经影像学文献在技术方面高度多样化。到目前为止,还没有对方法学选择如何影响观察结果进行系统性评估。

      在fMRI数据分析的多个阶段都涉及方法学选择。首先,胶质瘤患者FC研究的主要焦点涉及RSNs的潜在重组(Lv et al., 2022)。RSN拓扑结构的准确评估取决于功能数据到图谱模板(如MNI152)(Fonov et al., 2009)的准确配准。这是通过一系列步骤实现的,从患者结构数据的图谱配准开始。虽然最近的结果表明胶质瘤患者适合使用结构数据到图谱的非线性配准(Chen et al., 2021),但替代图谱配准策略对FC测量的下游影响仍未得到完全解决。其次,一旦功能数据准确配准到图谱模板,就通过分析从分布在整个大脑的感兴趣区提取的时间序列的相关性来计算FC。为了使这种分析最具信息性,提取时间序列的分区应该与大脑的功能组织相匹配。迄今为止还没有检验过替代分区方案对rs-fMRI可得出推论的影响。第三,已经确立RSNs是分层组织的(Doucet et al., 2011, Gotts et al., 2020)。单模态与跨模态(或称任务正性与任务负性)功能系统之间的区分定义了层级的顶部(Doucet et al., 2011, Fox et al., 2005, Huntenburg et al., 2018, Lee et al., 2012)。根据各种方案,这种二分法可以进一步细分为更精细的分区(Gordon et al., 2016, Schaefer et al., 2018, Yeo et al., 2011)。因此,理论上RSN组织在胶质瘤患者中的异常程度取决于分区的粒度。这个问题以前从未被研究过。最后,胶质瘤依赖的RSN结构变化已经使用各种图论测量进行了研究(Bullmore and Sporns, 2009, Rubinov and Sporns, 2010)。这些测量中哪些最能捕捉胶质瘤患者的特征性异常,以及上述方法学选择的下游影响仍不确定。

      因此,我们目前的工作主要集中在胶质瘤患者rs-fMRI分析的技术优化上,从根本上不同于将胶质瘤导致的功能网络变化与临床结果联系起来的大量论文。我们首先对文献进行了系统综述(见补充材料,表S1)。重要的是,我们关注胶质瘤患者FC分析的以下方面:(1)图谱配准;(2)分区方案;(3)分区粒度;和(4)图论测量。具体来说,我们对来自影像研究开放获取系列(OASIS3)数据集的163名健康成年人(LaMontagne et al., 2019)和来自华盛顿大学医学院(WUSM)神经外科脑肿瘤数据库的59名胶质瘤患者的数据进行组水平分析。

     首先,我们比较有掩模和无掩模的仿射vs非线性图谱配准,评估这些替代方案对结构标准化质量的影响。接下来,我们评估不同分区方案(AAL vs Brainnetome vs Schaefer)对几种FC测量的影响。然后,我们评估分区粒度如何影响基于全脑FC测量和图论测量区分患者与参考受试者的能力。最后,我们分析不同图谱配准选项对胶质瘤患者基于分区的FC异常测量的影响。在讨论部分,我们将当前文献综述与本研究结果联系起来。

2.方法

     本研究使用的整个分析方案概述见图1和图S5。

图1. 分析流程。

     A. 结构/功能图谱配准。BOLD fMRI数据通过以下序列获得的变换在图谱空间中重采样:EPI → T2 → T1 → MNI152。

     B. 功能连接分析。使用从分区提取的fMRI时间序列计算功能连接矩阵。所示矩阵是使用Schaefer分区获得的(最左面板)。将图论FC测量应用于获得的FC矩阵结果。关于结构和功能配准的详细信息包含在补充材料中。

2.1. fMRI数据集

2.1.1. 神经胶质瘤数据集
     患者数据集包含59名神经胶质瘤患者，年龄范围为22-82岁（平均年龄58岁），回顾性地在华盛顿大学医学院（WUSM）神经外科脑肿瘤数据库中筛选（数据采集时间：2012年10月-2017年5月）。纳入标准包括：首次诊断为原发性胶质母细胞瘤；年龄大于18岁；在WUSM进行的MRI扫描，包括用于术前规划的功能性磁共振成像（fMRI）；以及充分的肿瘤分割（即没有错误地将正常组织标记为肿瘤）（见2.2.1节）。排除标准包括：之前有脑部手术史或无法进行MRI扫描。所有分析均使用术前数据进行回顾性分析。由于该研究的回顾性特性，华盛顿大学机构审查委员会豁免了知情同意。患者使用3T Trio或Skyra扫描仪（西门子，德国厄尔朗根）进行扫描，采用标准的临床术前肿瘤扫描协议。解剖成像包括T1加权磁化准备快速采集（MP-RAGE）、T2加权快速自旋回波和FLAIR（流体衰减反转恢复）图像，所有图像的体素大小为(1 mm)³，用于肿瘤分割。静息态fMRI使用BOLD敏感EPI（回声平面成像）序列采集（体素大小(3 mm)³各向同性；回波时间=27毫秒；重复时间=2.2-2.9秒；视场=256毫米；翻转角度=90°）。每位患者获得两次静息态fMRI扫描（总计320帧）；每次扫描包含160帧。所有研究均由华盛顿大学机构审查委员会监督，以确保患者的隐私得到保护。

2.1.2. 参考数据集
     参考组包括163名个体（年龄43-93岁，平均67岁），从OASIS-3数据集中的1098名参与者中选择，以与患者组的年龄进行匹配。纳入标准为：参与者的首次扫描，其临床痴呆评定（CDR）评分在每次评估中均为零；使用西门子TIM Trio 3T扫描仪采集的MRI；至少有两次静息态fMRI扫描以及T1加权（T1w）和T2加权（T2w）结构图像。静息态fMRI数据包括两次6分钟的扫描（328帧），在此期间要求参与者保持静止，眼睛睁开（体素大小(3 mm)³各向同性；回波时间=27毫秒；重复时间=2.2或2.5秒）。

2.2. 图谱配准
2.2.1. 用于代价函数掩模的肿瘤分割
      肿瘤分割由预训练的3D卷积神经网络（CNN）执行（Isensee等人，2017），使用对比增强后的T1加权（T1w）、T2加权（T2w）和FLAIR图像（详细信息见补充材料S2.1）。T2w和FLAIR图像已与T1w进行刚性配准。所有图像在图谱空间中重新采样，在变换组合后：T2w → T1w → 图谱模板。肿瘤分割在图谱空间中进行。该算法生成一个多类肿瘤分割，区分血管源性水肿、坏死/非增强核心和增强核心。肿瘤分割经过人工检查，以验证肿瘤的准确描绘，并重新变换回患者空间。充分的肿瘤分割是纳入标准（见2.1.1节）。在随后的图谱配准过程中，解剖和功能数据的代价函数掩模包括所有三个肿瘤类别。

2.2.2. 使用代价函数掩模的图谱配准
     我们系统地比较了三种替代的图谱配准策略：（i）无掩模的12参数仿射配准（AFF）；（ii）无掩模的非线性配准（NL-M）；（iii）带代价函数掩模的非线性配准（NL+M）（Dobelbower等人）。初步研究表明，去除颅骨并未改善图谱配准，因此在此分析中省略了该步骤。所有图谱变换均由12参数仿射变换初始化，将患者的T1w与MNI152模板进行配准（Fonov等人，2009）。采用高级归一化工具（ANTs）差异性算法（https://www.nitrc.org/projects/ants）与对称归一化（Lindner等人）结合使用，配合无掩模（NL-M）或全肿瘤掩模（NL+M）。我们使用互信息作为优化度量。通过将仿射配准和非线性配准步骤获得的变换矩阵和形变场进行组合，得到结构图像到图谱空间的变换（图S5A，B）。

2.3. fMRI预处理
     初步的fMRI预处理遵循传统方法（Shulman等人，2010）。简而言之，包括补偿切片依赖时间偏移，消除由于交错采集造成的系统性奇偶切片强度差异，并对头部运动进行刚性体校正（Power等人，2012）。fMRI数据通过仿射变换的组合在图谱空间中重新采样，即功能数据平均 → T2w → T1w → 图谱模板（图1）。然后应用变形映射（见2.2.2节）对先前获得的仿射变换fMRI数据进行重新采样到(3 mm)³图谱空间（图S5B）。
     进一步的预处理为功能连接分析做准备，包括对每次fMRI运行的体素逐一去除线性趋势，进行低通滤波以保留低于0.1 Hz的频率，并回归去除噪声波形。噪声回归器来源于6个头部运动校正时间序列、从白质和脑脊液区域提取的时间序列（Behzadi等人，2007）以及全脑评估的信号。最后，应用空间平滑（6毫米全宽半最大（FWHM）高斯模糊）（图S5B）。
     使用DVARS（D表示时间序列的时间导数；VARS表示在体素间的RMS方差）度量进行帧剔除，DVARS基线显示个体间的变异性，当前尚未解释，但可能反映动脉pCO2的波动（Power等人，2019）。当前的帧剔除策略能够适应DVARS基线的变异性。算法的详细描述见补充材料（S2.2.）。

2.4. 静息态网络与分区
2.4.1. Schaefer分区
      静息态网络（RSN）在多个粒度层次上呈现层级化组织（Doucet等人，2011；Felleman和Van Essen，1991；Gotts等人，2020；Kaas，1987；Lee等人，2012；Yeo等人，2011）。这种组织理论上影响胶质瘤引起的功能连接异常的程度。因此，我们系统地改变了分区的粗细程度。最粗的层次对应于Yeo等人（2011）报告的7个RSN解决方案。更细的RSN分区如Schaefer等人（2018）报告的，包括从100到1000个不等的分区（Schaefer等人，2018）。

2.4.2. 替代分区方案
      我们进行了一个比较分析，分析了在胶质瘤神经成像研究中常用的替代分区方案。AAL分区（83个分区）基于解剖特征，主要是脑裂，在T1w扫描上成像（Tzourio-Mazoyer等人，2002）。Brainnetome分区（210个分区）基于自动分区、纤维束成像和功能连接分析的结合（Fan等人，2016）。在当前分析中，仅使用了Brainnetome分区中的皮层区域。我们进行了几项分析，以评估分区粗细对功能连接度量的影响。在这些分析中，AAL和Brainnetome的分区粒度与Schaefer方案相当，都是基于分区数量的。

2.5. 功能连接
     在每个RSN粒度层次上，从预处理后的数据中计算静息态功能连接（FC），数据在图谱空间（仿射或非线性配准）中重新采样到(3 mm)³的体素。更详细地说，FC通过计算从各个分区提取的时间序列之间的Fisher z变换皮尔逊时间相关性来得到。因此，FC以L×L对称矩阵的形式进行评估，其中L是与特定粒度层次相对应的分区数（详情见2.4节）。

2.6. 图谱配准评估 - 结构相似性
     每位患者的图谱变换后的T1w图像与MNI152模板进行比较。结构归一化的质量通过使用结构相似性（SSIM）指数（Matlab中的ssim函数）进行评估，计算变换后的T1w图像与MNI152模板之间的SSIM指数，排除肿瘤掩模中的体素。SSIM指数是三种独立比较的乘积组合：图像的平均像素强度、标准差以及图像中的交叉协方差结构（Wang等人，2004）。

2.7. 图论度量     

     我们评估了分区方案和分区粒度对图论度量的影响。先前的分析表明，仿射图谱配准未能实现结构数据与图谱的充分匹配（图2B）。因此，我们使用经过非线性配准和代价函数掩模（NL+M）预处理的功能数据评估了分区方案。对于每种分区方案和分区粒度，我们评估了基于功能连接矩阵二值化图的图论度量，这些度量作为图密度（10-30%每2%间隔）函数来计算。根据当前的常规实践（Bullmore和Sporns，2009；Rubinov和Sporns，2010），图的边仅定义为正相关。我们使用Brain Connectivity Toolbox评估了三种在rs-fMRI文献中常见的图论度量：

图 2. T1w 结构归一化

A. MNI152 模板。B. 使用仅仿射配准（AFF）得到的结果。C. NL-M：无掩模的非线性配准。注意肿瘤缩小。D. NL+M：带掩模的非线性配准。注意肿瘤未缩小。E. Friedman秩和Nemenyi事后检验结果，用于评估结构归一化质量（见补充材料S3.1）。

结构与MNI152的相似性使用第2.6节中描述的方法进行评估。对于每个患者，使用三种方法（AFF vs. NL-M vs. NL+M）的相似性从1到3进行排名，较低的排名表示质量较好。在所有患者中，AFF方法的相似性最低，100%的患者在AFF方法中显示排名为3。NL-M在36%的患者中取得了最佳结果。NL+M在64%的患者中取得了最佳结果。** Nemenyi得分 > 0.43（见第2.8.5节和补充材料S3.1）。

    1.模块度。模块度是一个全图度量，量化了网络能够被划分为离散群体的程度（Newman，2004）。

    2.全局效率。全局效率是一个全图度量，评估平均最短路径长度的倒数（Rubinov和Sporns，2010）。

    3.平均聚类系数。聚类系数度量基于网络中三角形的数量（Rubinov和Sporns，2010）。大量的三角形表明网络的分隔性，因为围绕节点的三角形比例被称为聚类系数（CC），等同于节点的邻居中也是互为邻居的比例。全局网络的平均CC反映了单个节点周围集群连接的普遍性。

2.8. 统计分析
2.8.1. 全宽半最大（FWHM）分析作为FC稳健性的度量
      在全局信号回归后，FC值的分布大致是零中心的（Fox等人，2009）。因此，稳健的FC特征是存在强正相关和强负相关，且这些相关性是在所有分区对中评估的。因此，通过编制所有分区对的FC分布宽度来衡量FC的稳健性。我们通过全宽半最大（FWHM）评估FC分布的宽度。

2.8.2. 置换测试图论差异
      我们评估了分区方案和分区粒度对组间差异的影响（胶质瘤患者与参考组），这些差异通过图论度量来评估（见2.7节）。我们评估了组均值的差异，并使用置换重采样（N = 2000）来评估统计显著性，如先前所述（Alexander-Bloch等人，2012）。因此，p值通过计算实际组差异超过通过置换组分配得到的空分布中的实例数，并将其除以置换次数来计算。多重比较校正按照先前描述的方法进行（Alexander-Bloch等人，2012），根据比较的上下文进行。具体而言，分区粒度选项和图密度选项的组合用作多重比较，以纠正假阳性（即N个粒度选项 × M个图密度选项，得出N × M次多重比较，p < 1 /（N × M））。

2.8.3. 相似性指数
      静息态网络（RSN）在多个粒度层次上呈现层级化组织（Doucet等人，2011；Felleman和Van Essen，1991；Gotts等人，2020；Kaas，1987；Lee等人，2012；Yeo等人，2011）。因此，健康个体之间显现的FC变异性依赖于分区粒度。具体而言，正常与异常个体之间的FC差异预计在细粒度分区中最为显著。我们定义相似性指数作为一种评估跨个体FC变异性的度量，并以分区粒度为参数评估这一度量（图4）。FC相似性通过向量化FC矩阵的内积来评估。关于相似性指数和分析逻辑的额外代数细节见补充材料（S3.2和S3.2.1）。

图 3. 分区方案对功能连接矩阵和图论网络度量的影响

     A. 分区示例，展示了AAL、Brainnetome和Schaefer 200分区。

     B 左：使用不同分区方案获得的相关矩阵值分布的全宽半最大（FWHM）。右：六个分区的FWHM值排名。箱线图表示163名参考个体的排名分布。较低的排名表示相对较大的FWHM。每个箱线图的高度表示不同个体间排名的标准差。排名的均值用圆圈表示。注意随着Schaefer分区粒度的增加，FWHM（排名较高）系统性减少（黑色箱线图）。AAL和Brainnetome显示的排名（较窄的FWHM）优于与之大小相当的Schaefer分区。

     C. 分区方案对使用图论度量评估组间差异显著性的影响。该图展示了图密度和分区粒度的双重效应。红色和蓝色行分别展示了使用AAL3和Brainnetome分区得到的结果。黑色行对应于不同粒度的Schaefer分区。注意，不论使用哪种分区，模块度评估中没有显著的组间差异。注意，使用AAL分区（红色行）评估的任何度量中均未发现显著的组间差异。注意，Brainnetome仅在稀疏图密度下对于效率度量显示显著差异。在低图密度和更细粒度的Schaefer分区中，效率和聚类系数的组间差异达到了显著性。

图 4. 分区粒度对功能连接一致性和组间分离的影响

     A，B. 163名参考个体（灰色）与59名患者（红色）之间的配对FC矩阵相似性。* p < 0.01，* * p < 0.005（详情见补充材料3，图S4）。在插图中，直方图重叠表示“：”符号表示矩阵与矩阵的相似性，通过对向量化的FC矩阵计算皮尔逊相关系数。

    C. 相似性指数测量为参考个体之间配对FC相似性值的平均值，除以这些值的标准差（上面面板显示灰色分布）。不相似性指数则通过对比参考个体之间（上面面板的灰色分布）和参考个体与患者之间（上面面板的红色分布）的配对相似性值，使用两样本Kolmogorov-Smirnov检验计算D统计量。有关这两个指数和分析逻辑的额外代数细节，请参见补充材料（S3.2和图S4）。

2.8.4. 患者与参考组不相似性指数
      不相似性指数是一个群体层面的定量度量，表示胶质瘤患者与参考个体之间全脑功能连接差异超出参考数据集中正常变异性的程度。我们预测不相似性指数强烈依赖于分区粒度。为了评估不相似性指数，我们首先计算所有个体和患者的FC矩阵。然后我们评估参考组内所有个体对的FC相似性与每个患者与参考组内所有个体配对时的FC相似性。这个计算生成了两个直方图，如图4A所示。更多的分析细节见补充材料S3.3。我们通过两样本Kolmogorov-Smirnov检验的D统计量（描述性使用）量化不相似性指数，这个统计量反映了两个分布之间的差异程度（图4C）。不相似性指数在所有Schaefer分区粒度层次（7，100-1000，间隔为100）下进行评估。有关不相似性指数和分析逻辑的更多代数细节，参见补充材料（S3.2，S3.2.2，图S4）。

2.8.5. 基于排名的非参数检验：图谱配准和分区方案的统计比较
      三种配准选项——AFF、NL-M和NL+M——被系统地比较。空间归一化的质量（见2.6.1节）与功能归一化的质量（见2.8.6节）分别进行评估。由于患者数据集在肿瘤大小和位置上差异显著，三种配准选项使用Friedman非参数检验进行比较（Eisinga等人，2017），该检验衡量配准选项在患者间的一致性，并返回一个接近卡方分布的Q统计量。Friedman检验用于评估结构数据和功能数据在配准选项上的依赖性。使用Nemenyi事后检验（Nemenyi，1963）评估三种配准选项之间的显著性差异。    

     我们还使用FWHM分析（见2.8.1节）系统地比较了6种分区方案（AAL，Brainnetome和4种不同粒度的Schaefer分区）。考虑到肿瘤的显著异质性，使用相同的Friedman非参数检验，并使用Nemenyi事后检验来确认配对差异的显著性。有关Friedman非参数检验和Nemenyi事后检验的更多细节，请参见补充材料（S3.1节）。

2.8.6. 基于功能连接度量的图谱配准选项评估
2.8.6.1. 分区同质性
     如果分区边界与大脑的功能组织良好对齐，那么给定分区中的所有体素应该表现出相似的功能连接性。这种相似性的度量被称为分区同质性（Gordon等人，2016）。我们如之前描述的那样评估了分区同质性（Gordon等人，2016）。简而言之，这包括计算每个体素在分区中的整个大脑连接模式。分区同质性被定义为通过主成分分析（PCA）对所有体素的FC进行的第一特征向量的方差占比。因此，如果该分区包含n个体素，PCA被应用于每个体素对应的n个FC图。我们为所有图谱配准选项（AFF，NL-M和NL+M）计算了分区同质性。

2.8.6.2. 分区异常
     我们为每个分区定义分区异常，表示患者组相对于参考组的FC差异超出了参考组中（正常）变异性的范围。分区异常的计算遵循与计算不相似性指数类似的方法，如2.8.4节所述。关键的区别在于，我们评估的是特定分区的FC，而不是整个矩阵的FC（更多细节见补充材料，S3.3节）。此外，我们使用Kolmogorov-Smirnov D统计量量化分区异常分数，这为两个分布之间的差异程度提供了度量。分区异常在所有图谱配准选项下进行了评估，但仅在最细粒度的Schaefer分区（1000个分区）中进行评估。
      理想情况下，分区异常应该反映出由胶质瘤引起的真实FC差异。然而，分区异常也可能是由次优的图谱配准引起的。为了区分观察到的分区异常的来源，我们将分区异常与分区同质性进行比较，使用不同的图谱配准选项（图5C）。这些计算的详细描述见补充材料（S3.3和图S4）。

图 5. 图谱配准选项对分区同质性和分区异常的影响。

     A. 分区同质性。显示了使用仿射配准（AFF）和带掩模的非线性配准（NL+M）的结果（实心条左侧），以及它们之间的差异（实心条右侧）。蓝色/绿色区域表示使用NL+M时具有更高的同质性；红色/黄色区域表示使用AFF时具有更高的同质性。

     B. 分区异常。显示了使用仿射配准（AFF）和带掩模的非线性配准（NL+M）的结果（实心条左侧），以及它们之间的差异（实心条右侧）。蓝色/绿色区域表示使用NL+M时具有更大的异常；红色/黄色区域表示使用AFF时具有更多的异常。

     C. Friedman秩和Nemenyi事后检验结果。较低的排名表示更高的分区同质性和较少的分区异常。大多数患者在使用AFF时显示最少的同质性和最多的异常。最高的同质性和最少的异常在非线性配准（无论是否带掩模，NL-M、NL+M）下表现得最为相似。** Nemenyi得分 > 0.43（见补充材料S3.1）。

3.结果
3.1. 使用不同图谱配准选项的空间归一化
     图谱配准策略的影响如图2所示。通过不同方法获得的空间归一化结果的视觉检查显示了接近病变区域的差异（见图2；箭头）。具体而言，仿射配准（AFF）（图2B）保持肿瘤相对于大脑其他部分的比例。非线性配准（不带掩模，NL-M）（图2C）会使病变缩小，扭曲附近区域，并模糊肿瘤边界。使用带掩模的非线性配准（NL+M）（图2D）保持了肿瘤的相对比例，如仿射配准结果所示，同时比仿射配准更紧密地将大脑的其他部分变形以匹配模板。面板E报告了图谱配准选项对结构归一化的显著影响（Friedman秩检验，p = 1.31e-20）。在此评估中排除了肿瘤体素。此外，Nemenyi事后检验结果强调，与使用仿射配准相比，使用非线性配准显著改善了结构相似性（图2E中的星号）。掩模的影响不显著。

3.2. 分区方案对FC矩阵和图论网络度量的影响
     图3展示了分区方案和分区粒度对FC分布宽度和图论度量的影响。图3A展示了AAL、Brainnetome和Schaefer分区方案叠加在图谱模板上的样子。我们比较了使用6种不同分区方案（AAL与Brainnetome与不同粒度的Schaefer方案）评估的FC稳健性。FWHM（全宽半最大）作为FC稳健性的度量（图3B）。FWHM分析显示，功能组织与大脑功能匹配良好的分区方案产生了稳健的FC（即较大的FWHM）。相反，与大脑功能组织匹配较差的分区方案则生成较弱的FC（即较低的FWHM）。每种方案的排名顺序通过箱线图表示（较低的排名表示较大的FWHM值）。所有结果都以分区数为函数绘制。相同粒度层次下，Schaefer方案相较于AAL和Brainnetome方案始终产生更稳健的FC（图3B）。这一结果表明，Schaefer分区方案与人类大脑的功能组织最为一致。一般来说，FC的稳健性在较粗的分区下更大，尽管这一关系在Schaefer方案中表现得最为系统。

     图3C展示了分区方案和粒度对使用三种图论度量（模块度、全局效率和平均聚类系数）评估患者与参考个体差异的影响。对比两个组之间的显著性在图密度和分区粒度上进行参数化评估。检查图3C显示，患者与参考个体之间的对比在稀疏图密度和更细的分区粒度下最为显著。在研究的三种图论度量中，组间差异在全局效率度量中最为明显。较细的Schaefer分区和Brainnetome方案在稀疏图密度下都显示出全局效率的显著组间差异。平均聚类系数也显示了显著的组间差异，但仅在Schaefer方案中。Brainnetome方案在相同粒度下不如Schaefer方案（图3C，蓝色框，中间面板）。具体而言，显著的Brainnetome差异仅出现在效率度量上，并且仅在稀疏图密度下。值得注意的是，AAL分区在任何图密度下使用任何图论度量均未显示显著的组间差异（图3C，红色框）。图S7进一步扩展了这些结果，重点展示了Schaefer分区方案的更多细节。

3.3. 基于分区粒度的全脑组间对比
      图4A展示了在组内和组间评估的FC相似性的直方图。灰色直方图表示所有参考个体的配对。红色直方图表示所有患者与参考个体配对的方式。对于大于100的分区粒度，FC矩阵相似性在组内（仅参考个体）大于组间（两样本Kolmogorov-Smirnov检验，根据D统计量分配星号；图4B）。这一结果在图4A中表现为灰色直方图相对于红色直方图的位移。注意，在最粗的分区（7个分区）下，患者与参考组之间的FC差异不显著，但随着分区数量的增加，差异逐渐变得更为明显。

      图4C展示了在分区粒度下，参考组内相似性（黑色条）和组间不相似性（红色条）的变化。参考组内相似性在最粗的分区中最大，并随着粒度的增加系统性下降（黑色条）。组间不相似性则呈现出与分区数量的反向依赖（红色条），但在大约400个分区时趋于平稳。因此，结果表明，基于全脑FC的胶质瘤患者与参考个体的区分随着粒度的增加而改善，直到某一水平。

3.4. 使用不同图谱配准选项计算的分区同质性和异常     

     当前的结果表明，随着分区粒度的增加，FC的不相似性变得越来越明显（图4）。鉴于这一发现，我们将分析扩展到在最细的分区层次上对比两组，识别患者中功能性改变的脑区。精确量化分区层次的FC异常依赖于分区边界与大脑真实功能组织的精确对齐，这在图5A中作为分区同质性进行评估（详细信息见2.8.6.1节）。
      图5A展示了替代图谱配准策略对患者组中分区同质性的影响。分区同质性依赖于分区，并且通常在大脑的主要感觉/运动区域中最强，而在多模态区域（如前额皮质）中最弱（图5A左侧两面板）。最右侧面板展示了分区同质性的差异。非线性图谱配准通常会改善所有分区的分区同质性（较冷的色调）。这种定性评估通过Friedman秩检验（p = 6.14e-13）和Nemenyi事后检验（图5C中的星号）得到了定量验证。
分区异常等同于不相似性指数（见2.8.6.2节），并且仅限于FC矩阵的一行（见补充材料S3.3）。上述关于图谱配准对分区同质性影响的结果意味着，检测真正的分区FC异常的能力取决于准确的图谱配准。不准确的图谱配准可能导致FC异常的假象。这个结果在图5B中有所说明。具体而言，仿射图谱配准导致分区异常分数膨胀，尤其是在扣带皮质中（图5B右侧的红色色调）。这一效应最有可能反映了仿射配准无法校正中线位移的问题，而这种位移在胶质瘤患者中很常见。在左侧颞叶中观察到了相反的结果（图5B右侧的绿色分区），我们的患者样本中的肿瘤频率为左侧偏侧（图S7）。因此，假设在左侧颞叶使用NL+M图谱配准检测FC异常的灵敏度增加，反映了肿瘤附近大脑部分的真正异常。这一假设可以通过未来的研究得到验证。
     分区同质性与分区异常之间的关系在图5C最左侧的面板中有所展示，显示了患者间的散点图。非线性图谱配准通常改善了分区同质性（大多数患者位于垂直线左侧）并减少了分区异常（大多数患者位于水平线以上）。这一结果进一步验证了图5B中的结果，因为改进的图谱配准增加了分区同质性并减少了分区异常。

4.讨论

4.1. 结果概述
     我们评估了图谱配准选项、分区粒度和分区方案在胶质瘤患者与一组年龄匹配的参考个体之间对比FC时的影响。两组之间的差异强烈依赖于这些方法学选择。我们的关键发现如下：

    （1）非线性图谱配准是必需的，以补偿胶质瘤大脑中的解剖畸变。使用仿射图谱配准会导致FC异常的假象。理论上，代价函数掩模可能会影响结果。然而，在我们的结果中，代价函数掩模的影响并不显著。

  （2）功能性分区方案（例如Schaefer等人，2018）相比解剖学分区方案（AAL/Brainnetome）能够最大限度地提高检测胶质瘤引起的FC异常的灵敏度（图3）。

   （3）在评估胶质瘤患者FC异常时，必须考虑正常个体的FC变异性。这个观点在我们的分区异常映射策略中是隐含的。胶质瘤患者中的FC异常在基于细粒度分区的分析中最为显著（图4）。

   （4）许多前期工作使用图论度量评估胶质瘤患者的FC（见补充材料S1，表S1中的文献综述）。如前所述，并非所有这些度量在胶质瘤患者中对FC异常的敏感性是相同的。特别是，模块度在胶质瘤患者中似乎没有变化。重要的是，使用图论度量评估的患者和参考个体之间的差异仅在细粒度分区下显现。

4.2. 本研究结果与现有文献的关系     

     许多研究已经建议了用于研究没有脑肿瘤的个体的最优fMRI分析方法。然而，据我们所知，现有的研究尚未全面解决这一问题，尤其是在胶质瘤患者的rs-fMRI分析背景下。此外，也没有系统地比较过不同方法对观察结果的影响。为了解决这一空白，本研究聚焦于胶质瘤患者rs-fMRI分析的技术优化。我们首先进行了文献的系统回顾（见补充材料1，表S1）。我们发现，之前的工作使用了多种图谱配准策略、基于种子的FC或独立成分分析、不同粒度层次的多种分区方案，以及各种的图论度量。大多数实施基于种子的FC方法的研究使用了解剖学派生的分区方案，例如AAL。分区粒度从7个网络分区到体素级分析不等。有关现有文献的更多细节，见补充材料。在接下来的讨论中，我们根据本研究的结果讨论现有文献。重要的是，我们报告了替代技术方法对观察结果的重大影响。

4.2.1. 非线性图谱配准改善结构归一化和分区同质性
      胶质瘤患者的结构归一化（即将个体大脑与图谱代表模板匹配）是一个非平凡的挑战，因肿瘤效应导致正常组织的破坏和解剖畸变。非线性配准与代价函数掩模（CFM）和胶质瘤图像分割与配准（GLISTR）（Gooya等人，2012）已被提出作为改善脑肿瘤患者空间归一化的一种方法。然而，如几篇综述文章所指出的，以及我们自己回顾的（见补充材料1，表S1），现有文献中胶质瘤患者FC的研究存在图谱配准方法的显著异质性（Fox和King，2018；Ghinda等人，2018）（表S1）。前期工作（不在表S1中）比较了图谱配准方法，但仅限于结构归一化（Brett等人，2001；Crinion等人，2007；Ripolles等人，2012）。在我们对文献的回顾中，我们仅发现一篇报告系统地讨论了图谱配准对FC度量的影响（Chen等人，2021）。我们同意Chen等人提出的观点，认为在研究胶质瘤患者时应该使用非线性图谱配准，并且代价函数掩模对结果没有显著影响。重要的是，Chen等人使用了基于AAL的FC（粗解剖学分区）衍生的图论度量作为评估图谱配准质量的主要指标，而我们已经证明该方法并不理想。

      基于功能的分区方案，例如Schaefer等人（2018），符合大脑的内在功能组织，而基于解剖的方案，例如AAL（Tzourio-Mazoyer等人，2002），则不符合（Craddock等人，2012；Shen等人，2013）。如我们用FWHM度量所示，非功能性分区方案会导致不稳健的FC估计，并降低FC分析在检测患者与对照之间差异时的灵敏度（图3）。因此，我们评估了图谱配准质量，通过分区同质性（Gordon等人，2016）直接评估分区与大脑功能组织的匹配情况。相比之下，图论度量通过降级的FC间接评估这一点。此外，精细分区比粗分区更容易受到配准误差和个体间变异性的影响（图4）。

4.2.2. 基于功能的分区方案提高FC的稳健性
     先前的研究表明，功能性分区方案相较于解剖性分区方案（例如AAL）更好地与大脑的功能组织匹配（Craddock等人，2012；Gordon等人，2016；Shen等人，2013）。这一基本发现在本研究中得到了重复（图3）。分区方案对图论度量的值有很大影响，这些度量在比较胶质瘤患者与对照组时可能非常重要。然而，要有效地进行这种比较，必须确保分区方案与大脑的功能组织匹配。在这一背景下，解剖学分区方案表现不佳，即使在控制了相同分区粒度后（图3C）。我们注意到，58项先前的胶质瘤患者FC研究中，有27项使用了解剖学分区（AAL/Brainnetome/Harvard-Oxford/Brodmann）。

4.2.3. 胶质瘤患者的FC异常仅在细粒度分区下显现
     静息态网络（RSN）具有层级组织结构（Doucet等人，2011；Gotts等人，2020）。因此，基于FC分析得出的推断可能依赖于分区粒度。已经提出了多种方案，这些方案逐步细化了RSN的细分（Schaefer等人，2018；Yeo等人，2011），但普遍认为，单一模态与跨模态（或任务正性与任务负性）系统的区分定义了层级结构的顶端（Doucet等人，2011；Fox等人，2005；Huntenburg等人，2018；Lee等人，2012）。在正常个体中，大脑功能组织的个体间差异主要在细空间尺度上显现，即在几毫米的范围内（Gordon等人，2017）。我们的结果表明，类似的原理也适用于胶质瘤患者中的FC异常。具体而言，FC异常在粗粒度分区下不太显现，而随着分区粒度的增加（到达一定点后，图4C），这些异常变得越来越明显。然而，我们注意到，36项先前的研究中只有8项使用了至少200个分区的分区方案（表S1）。

4.2.4. 图论度量强烈依赖于分区方案和分区粒度
     表S1中大约四分之一的研究评估了胶质瘤对FC的影响，基于图论度量进行。在这些研究中，除一项外，所有研究都使用了解剖学分区（例如7项使用AAL图谱，4项使用Brainnetome图谱，一项根据解剖标志定义ROI）；一项使用了混合标准定义ROI。然而，我们的结果表明，在图论分析的背景下，解剖学分区方案相比功能性分区方案表现较差，即使在控制了相同的分区粒度后（图3C）。此外，图论度量强烈依赖于图谱配准策略（Chen等人，2021）。我们还同意Hallquist和同事提出的问题，即在评估组间差异时使用图论度量存在的问题（Hallquist和Hillary，2019）。具体而言，研究之间方法学的异质性削弱了已发布结果的可重复性（Hallquist和Hillary，2019）。     在这里，我们没有对文献中使用的所有图论度量进行全面比较（见表S1）。我们评估了三种常用的度量，包括全局效率，这在胶质瘤FC研究中普遍使用（见2.7节，表S1）。重要的是，我们专注于评估图论度量，参数化分区粒度和图密度（图3C和图S7）。据我们所知，这种实验设计是新的，因为之前的工作并未系统地检查分区粒度的影响。我们的结果支持使用全局效率和平均聚类系数作为对胶质瘤影响敏感的度量，前提是分析使用细粒度功能分区并在稀疏图密度下进行（图3C和图S7）。目前的观察结果提出了关于胶质瘤如何引发功能重组的新问题。回答这些问题需要更大的样本量，以考虑胶质瘤等级和肿瘤位置的异质性。

4.2.5. 非线性图谱配准减少分区异常
     本研究中最显著的发现之一是，非线性图谱配准通常减少了胶质瘤患者FC异常的表现（图5）。相比之下，仿射图谱配准可能会导致由于配准不准确而产生FC异常的假象。我们注意到，58项研究中有16项使用仿射（或未指定）图谱配准对比胶质瘤患者与对照组（表S1）。真实的FC异常可能源于正常功能的脑实质或白质的破坏、神经血管耦合受损（Ulmer等人，2003）、血管运动（Rayshubskiy等人，2014）以及可能的功能重映射（Lv等人，2022）。本研究没有区分这些可能性。

4.2.6. 局限性
     关于非线性图谱配准，可能存在ANTs的替代方案，例如DARTEL、DRAMMS或GLISTR，这些可能提供优势（Ashburner，2007；Gooya等人，2012；Ou等人，2011）。我们机构的临床影像学（至少目前）不包括场映射或为促进畸变校正而设计的高级方法。因此，本研究未能进行易感性不均匀性的校正。我们的数据集中肿瘤频率呈左侧偏侧，这在一般的胶质母细胞瘤人群中并不常见。因此，我们的患者样本无法支持关于肿瘤在大脑不同部位对FC的影响的一般性研究。对于图论分析，我们应用了全局阈值处理以生成二值化的FC矩阵；未来的工作可以考虑比较全局和局部阈值处理，并探索其他图构建方法。我们将一个基于功能的分区方案（Schaefer等人，2018）与两个解剖学分区方案进行了比较。其他功能性分区方案（Gordon等人，2016；Power等人，2011；Shen等人，2013）可能有助于提高我们对肿瘤引发的FC变化的理解。最后，和大多数先前关于胶质瘤患者FC异常的研究不同（表S1），本研究聚焦于这种类型研究的技术方面，旨在最大化患者与对照之间的差异。我们未对胶质瘤患者的特定FC异常或功能重组作出声明。此类声明将推迟到未来对更大数据集的研究中进行。

5.结论
     评估胶质瘤引起的功能连接组改变依赖于关于结构归一化、分区方案和分区粒度的多种方法学选择。我们回顾了静息态fMRI胶质瘤文献中常用的方法，并系统地评估了这些选择对观察胶质瘤患者组中FC异常的影响。基于我们的发现，我们提出了几条关于使用静息态fMRI研究胶质瘤患者的建议。首先，需要非线性图谱配准来补偿解剖畸变，从而减少FC异常的假象。其次，我们建议使用功能性分区方案，而不是解剖学分区方案，以提高检测真实胶质瘤引起的FC异常的灵敏度。第三，所有个体的FC变异性取决于分区粒度；在研究胶质瘤患者的FC异常时，应该考虑这一点。重要的是，使用图论度量评估的胶质瘤患者FC异常在较细粒度的分区中最为明显。